農(nóng)業(yè)部指定非洲豬瘟試劑盒使用說明書

（快提核酸擴(kuò)增試劑盒）

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：農(nóng)業(yè)部指定非洲豬瘟試劑盒（PCR熒光探針法） 英文名稱：Diagnostic Kit for African Swine Fever Virus （PCR Fluorescence Probing）

［預(yù)期用途］

本試劑盒主要用于檢測疑似感染豬抗凝血及臨床病料中的非洲豬瘟病毒（ASFV,African Swine Fever Virus）核酸，適用于非洲豬瘟病毒的檢測、輔助診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

【試劑盒組分】

1、試劑盒組成及貯藏條件

2、需自備材料：生理鹽水、無菌槍頭、熒光PCR專用反應(yīng)管、記號筆等。

【操作步驟】一、樣品制備

1、血液樣品：采集抗凝血（抗凝劑為EDTA）或血清樣品，編號備用。

2、組織樣品：采集脾臟、肝臟、淋巴結(jié)、扁桃體等病變組織樣品或軟蜱0.1g（黃豆粒大小），眼科剪剪碎于組織勻漿器或研缽中充分勻漿或研磨，再加1mL生理鹽水混勻，4°C條件下8000rpm/分鐘離心2分鐘，取上清液于滅菌離心管中，編號備用。

二、DNA提取

取反應(yīng)液A 20μL分別加入到新的1.5mL離心管，加入抗凝而或血清或組織上清液2μL混勻，室溫（20°C左右）靜置3分鐘，加入反應(yīng)液B 20μL,吹打混勻即可，若為抗凝全血，則需8000rpm/分鐘再離心2分鐘后做為待檢DNA溶液。

二、PCR擴(kuò)增

1、配液：取出PCR反應(yīng)液、酶混合液，在室溫完全融化后，充分混勻，瞬離，可將酶混合液全部取岀直接加入到PCR反應(yīng)液中，充分混勻，瞬離后按每份20μL分裝使用；或按照每份PCR反應(yīng)液17μL,酶混合液3μL的比例取一定的試驗(yàn)用量，混合兩種反應(yīng)液,瞬離后按照每份20μL分裝到專用熒光PCR 反應(yīng)管中，剩余試劑立即凍存；（操作過程要注意避光）

2、加樣擴(kuò)增：分別向上述PCR反應(yīng)管中加入5μL樣本 DNA或陰性對照或陽性對照，混勻并瞬離,放入熒光PCR儀上運(yùn)行以下程序：

步驟 條件 循環(huán)數(shù) UNG處理 50°C：2分鐘1 預(yù)變性 95°C：3分鐘1 預(yù)擴(kuò)増 95°C：8秒55C：8秒5 PCR擴(kuò)增 95°C：8秒55°C：8秒40

熒光通道選擇FAM,在40循環(huán)階段每個(gè)循壞的55°C時(shí)收集熒光信號。設(shè)置擴(kuò)增體系為25μL,同時(shí)要選擇 passive reference 和 quencher 為 none 的模式。

(注:若熒光PCR儀(如ABI7500)按說明書中的反應(yīng)程序設(shè)置后因持溫時(shí)間短無法運(yùn)行,可將預(yù)擴(kuò)增和PCR擴(kuò)增條件變更為95°C：5秒55°C：30秒。)

【結(jié)果判定】1、基線和閾值設(shè)定；基線調(diào)整取6-15個(gè)循環(huán)的熒光信號，閾值設(shè)定以閾值線剛好超過陰性對照檢測熒光曲線的最高點(diǎn)為原則。

2、質(zhì)量控制：反應(yīng)結(jié)束后，陰性對照的檢測結(jié)果應(yīng)無特定的擴(kuò)增曲線，Ct值為＞38或無；陽性對照 的Ct值應(yīng)≤30.0,且明顯的擴(kuò)增曲線；否則實(shí)驗(yàn)視為無效。

3、樣品判定：待檢樣品熒光信號有指數(shù)型增加，且結(jié)果顯示Ct值<35.0,報(bào)告為陽性；未檢測到Ct 值或Ct值＞38或無明顯擴(kuò)增曲線，則樣品判定為陰性。35≤Ct值≤8時(shí)，復(fù)檢一次，重復(fù)結(jié)果為陽性者判定為陽性，否則判定為陰性。

【注意事項(xiàng)】1、實(shí)驗(yàn)前請仔細(xì)閱讀本試劑盒說明書，嚴(yán)格按照操作步驟執(zhí)行，在操作過程中對時(shí)間、試劑體積等精確控制可以獲得最好的結(jié)果。

2、實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照有關(guān)規(guī)定分區(qū)管理。各區(qū)間人員、器材、試劑及空氣流向應(yīng)有產(chǎn)格要求。

3、有關(guān)耗材確保潔凈、無菌，核酸提取完成后盡快進(jìn)入下一步試驗(yàn)或冷凍保存。

4、預(yù)混后的試劑應(yīng)盡量在短期內(nèi)使用完畢，戶外使用應(yīng)在加冰袋的泡沫盒保存，每日試驗(yàn)完畢應(yīng)及時(shí)冷凍保存。

5、對于熒光PCR管要避免徒手或使用過的手套接觸，檢測過程中使用不帶熒光物質(zhì)一次性乳膠手套。

6、凍存試劑使用前應(yīng)于室溫下完全融化，充分混勻，瞬時(shí)離心使液體完全沉于管底。

7、樣品、陰性對照封蓋后，在通風(fēng)環(huán)境添加陽性對照并及時(shí)封蓋，避免組分間及氣溶膠等假陽性污染。

8、擴(kuò)增反應(yīng)完畢后的PCR管嚴(yán)禁開蓋,應(yīng)和試驗(yàn)產(chǎn)生的其它廢棄物一起及時(shí)收集,遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行無害化處理。

【規(guī)格】50頭份/盒。

【貯藏與有效期】-20°C以下避光保存，有效期12個(gè)月。

僅供獸醫(yī)診斷使用